کیتین: پلیمر طبیعی،درمانگر زخم
مواد استفاده شده
در اين پژوهش از منومر كيتين(Gl¬c¬NA c¬)، اليگومر كيتين (NACOS) و پليمر كيتين و همچنين از منومر كيتوسان (Gl¬c¬N)، اليگومر كيتوسان (COS)و پليمر كيتوسان استفاده شد.
كيتين ( باوزن مولكولي 300KD ) و كيتوسان ( با وزن مولكولي 80KD ) با ميانگين سايز 5/3 ميكرو متر به وسيله گاز اتيلن اكسايد استريل شدند و در محلول بافر فسفات ( PBS با PH=7/2 ) با غلظت 10 ميلي گرم بر ميلي ليتر معلق مي‌شوند. كيتين و كيتوسان به ترتيب شامل DDهاي كمتر از 10 درصد و بيشتر از 80 درصد هستند .
اليگومرها و منومرها در محلول PBS با غلظت 10 ميلي گرم بر ميلي ليتر حل شدند و از فيلترهاي با روزنه‌هاي 45/0 ميكرو متر عبور كرده و استريل شدند، و سپس نمونه‌ها در 3 غلظت، 1/0، 1 و 10 ميلي گرم بر ميلي ليتر با PBS تنظيم شدند.
چهار نمونه مختلف دي استيله شده كيتين (DAC) ( با 14% و 23% و 63% و 96% ) با يك وزن مولكولي يكسان (50KD) تهيه شد و به صورت پودري با ميانگين سايز 6 تا 8 ميكرومتر استريل شده و به همان روش تنظيم كيتين و كيتوسان تنظيم شده‌اند، پودر‌ها با DD 100% رابا (DAC100) نشان مي‌دهند.
وزن مولكولي در اين تحقيق توسط روش viscosity و DDهم توسط روش IR و يا روش colloidal titration تعيين شده است.
طرح آزمايش
از 72 عدد موش ماده Wistar ( با وزني حدود 300±20gr ) در اين تحقيق استفاده شده است. پس از اينكه موهاي پشت موشها تراشيده و قسمت تراشيده شده با (يدI ) ضد عفوني شد، 2 زخم برشي ضخامت كامل (با طول 4 سانتي متر ) در حالت بي هوشي با چاقوي جراحي روي پشت موشها ايجاد مي‌شود. پس از اينكه خونريزي متوقف شده با 100 ميكروليتر از هر نمونه زخم شتسشو داده مي‌شود و سپس زخم با بخيه هايي از جنس Stainless Steel بخيه مي‌شوند . هفت روز بعد از جراحي حيوانات اتانازي (كشته) مي‌شوند و از بافت پوست در محل زخم نمونه برداري مي‌شود. در بررسي استحكام زخم بهبوديافته يك نوار از پوست ( با 1 سانتي متر عرض و 2 سانتي متر طول ) از وسط محل زخم در هر نمونه برداشته مي‌شود. حداكثر استحكام تا زماني كه پوست از محل برش پاره شود، با loud gauge و كشش‌سنج اندازه‌گيري شد.
اطلاعات به دست آمده به سطح مؤثر تقسيم شده ( 5 ميلي متر از خط برش در هر نمونه ) و در آخر بر حسب نيوتن بر ميلي متر مربع بيان شده (N/mm2) ، در ديگر نمونه‌ها ( نمونه‌هاي دوم ) ميزان آنزيم كلاژناز با دستگاه اندازه گيري كلاژن نوع I اندازه گرفته شد و مشاهدات بافت شناسي نيز انجام گرفت.
تحليل‌ها
اثر وزن مولكولي روي استحكام بهبوديافته و فعاليت آنزيم كلاژناز
اثر وزن مولكولي روي استحكام زخم بهبود يافته در شكل 1 نشان داده شده است .
استحكام زخم بهبود يافته در همة نمونه‌ها افزايش قابل توجه اي در مقايسه بانمونة شاهد (Saline) داشت. در گروه كيتين ( شامل : كيتين،GlCNAc ، NACOS) و كيتوسان ( شامل : كيتوسان و GLCN ، COS ) بيشترين تأثير مربوط به اليگومرها (NACOS , COS) بود. وقتي گروههاي كيتين و گروههاي كتيوسان با هم مقايسه شدند، مشخص شد، كه گروههاي كيتوسان در يك وزن مولكولي يكسان اثر بيشتري از گروههاي كيتين دارند، و همچنين اثر غلظت mg1/0 از بقيه غلظت‌ها براي هر كدام از نمونه‌ها بيشتر بود.
اثر وزن مولكولي روي فعاليت آنزيم كلاژناز در شكل 2 نشان داده شده است.
فعاليت آنزيم كلاژناز در همة نمونه‌ها افزايش قابل توجه اي را در مقايسه با نمونه شاهد نشان داد و در گروههاي كيتوسان منومرGLCN بيشترين تاثير را داشت، در حاليكه در گروههاي كيتين اختلاف زيادي وجود نداشت.
فعاليت آنزيم كلاژناز در گروههاي كيتوسان بيشتر از گروههاي كيتين است. اختلاف زيادي بين فعاليت آنزيم كلاژناز در غلظت‌هاي مختلف نمونه‌ها وجود نداشت ولي اين ميزان براي غلظت mg 1 كمي بيشتر از ساير غلظت‌ها بود.
در يافته‌هاي بافت شناسي مشخص شد، كه در گروههاي كيتوسان نسبت به گروههاي كيتين فيبرو بلاست‌هاي بيشتري در اطراف زخم بودند و فيبرهاي كلاژني در اليگومرها(NACOS,COS)به صورت عمود بر خط برش رشد كردند(شكل 3)، در حاليكه در نمونه شاهد و منومرها(,GLCNAC GLCN) اين فيبرها به صورت موازي با خط برش رشد كردند(شكل 4).
اين تحقيق نشان مي‌دهد، كه نه تنها كيتين و كيتوسان بلكه منومرها واليگومرهاي آنها نيز سرعت ترميم زخم را افزايش مي‌دهند، هر چند كه اين قضيه كاملا آشكار نيست. به هر صورت كيتين و كيتوسان به علت اينكه به وسيله برخي از آنزيم‌ها در محيط زخم به مونومرها و اليگومرهايشان تخريب مي‌شوند، مستقيما در ترميم زخم اثر گذارند، و در اين تحقيق ثابت شده كه اليگومرها تأثير بيشتري دارند.
نمي توان به درستي توضيح داد، كه چرا اليگومرها اثر بيشتري بر روي ترميم زخم دارند . با وجود اين يك جواب مطرح است: نمونه با سايز مولكولي مختلف در زخم استفاده شده و درجه تخريب براي هر نمونه متفاوت است، بنابراين در پليمر كيتين و كيتوسان زمان بيشتري براي تخريب و جذب در زخم به علت وزن مولكولي بالا لازم است. در حاليكه منومرها به علت وزن مولكولي كم به سرعت جذب مي‌شوند، به علاوه اليگومرها هم از اين جهت مناسب هستند.
نه فقط كيتين و كيتوسان بلكه اليگومرها و منومرهايشان هم فعاليت آنزيم كلاژناز را افزايش مي‌دهند. فعاليت آنزيم كلاژناز با تغيير شكل زخم در طي فرآيند ترميم زخم رابطه دارد. اين آنزيم به طور عمده توسط فيبروبلاست‌ها و سلول‌هاي التهابي توليد مي‌شود. در مشاهدات بافت شناسي فيبروبلاست‌هاي بيشتر و سلول‌هاي التهابي كمتري در اطراف زخم ديده شده كه نشان دهنده اين است، كه فيبروبلاست‌ها به طور عمده آنزيم كلاژناز را توليد مي‌كنند. اين پديده به اين معني است، كه كيتين و كيتوسان و مواد حاصل از تخريب آنها بر روي شكل زخم در طي فرآيند ترميم زخم تاثير مي‌گذارند. تحقيقاتي كلينيكي وجود دارد، كه نشان مي‌دهد كه جاي زخم در حضور كيتين و كيتوسان به حداقل ميزان خود مي‌رسد.
در اين تحقيق رنج غلظت همه نمونه‌ها از 1/0 تا 10 ميلي گرم بر ميلي ليتر، باعث افزايش سرعت ترميم زخم شده و فعاليت آنزيم كلاژناز را نيز افزايش داده است.
از نمونه‌ها با ميزان غلظت 1/0 تا 10 ميلي گرم بر ميلي ليتر استفاده شده و 1/0 ميلي ليتر از هر نمونه روي زخم‌ها قرار داده شد، (4 سانتر متر * 1 سانتي متر سطح زخم) كمترين وزن هر نمونه 01/0 ميلي گرم (10 ميكروگرم) است. با توجه به اينكه همه غلظت‌ها براي تسريع در بهبود زخم كافي هستند بنابراين براي بدست آوردن حداقل غلظت موثر بايد اثر غلظت‌هاي كمتر هم بررسي شود.
اثر DD روي استحكام زخم‌هاي بهبوديافته و فعاليت كلاژناز
جدول 1 اثر DD را روي استحكام زخم‌هاي بهبوديافته و فعاليت كلاژناز را نشان مي‌دهد.
مقدار هر دو پارامتر در همه نمونه‌ها افزايش قابل توجه اي نسبت به نمونه شاهد دارد.
هرچهDD بيشتر باشد، استحكام زخم بهبوديافته و فعاليت آنزيم كلاژناز بيشتر است، و همچنين در مطالعات بافت شناسي درDDهاي بالا فيبروبلاست‌هاي فعال شده بيشتري مشاهده شده است(شكل 5 و 6)
شكل 5 و 6
نتیجه گیری:
نتيجة اين تحقيق با تحقيقات گذشته سازگار است. علاوه بر كيتين و كيتوسان منومرها و اليگومرهاي آنها هم فرآيند ترميم زخم را تسريع مي‌كنند . استحكام زخم بهبوديافته و فعاليت آنزيم كلاژناز در گروههاي كيتوسان بيشتر از گروههاي كيتين است.
در مطالعات بافت شناسي مشخص شد كه كلاژن در جهت عمود بر خط برش در گروههاي اليگوساكاريد (NACOS,CAS) رشد كرده و تعدادي فيبروبلاست‌هاي فعال شده در اطراف زخم در گروههاي كيتوسان نشان داده شد.
و در مورد درجه دي استيله شدن، هرچه اين درجه بالاتر باشد استحكام زخم بهبوديافته و فعاليت فيبرو بلاست‌ها افزايش بيشتري را نشان مي‌دهند.
شكل 1) اثر وزن مولكولي روي استحكام زخم بهبوديافته
شكل 2) اثر وزن مولكولي روي فعاليت آنزيم كلاژناز
کارشناسی ارشد بیومتریال